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武蔵国多摩郡石田村の農家に生まれ、家伝薬石田散薬の行商のかたわら剣術を学び、幼なじみの近藤勇が継いだ天然理心流試衛館の一員として1863年、将軍警護の浪士組に加わって上洛し、京都で新選組の結成に加わって副長となった。以後、京都の治安維持に力を尽くした。局中法度を定めて隊士を厳しく統率し、池田屋事件などを経て新選組の武名を高めた。その厳格な統率ぶりは「鬼の副長」の異名の由来になったとされる。鳥羽・伏見の戦い後は近藤が率いる甲陽鎮撫隊に加わって甲州勝沼の戦いに臨んだが敗れ、近藤の投降後は歳三が事実上組を率いて宇都宮城や会津・母成峠の戦いを転戦した。会津落城後は仙台を経て榎本武揚らと蝦夷地へ渡り、箱館では陸軍奉行並として軍事を統括して新政府軍と戦ったが、1869年5月、箱館一本木関門付近で戦死した。享年35。局長近藤亡きあとも新選組の理念を貫いて戦い抜いたその生涯は、幕末を象徴する武士像として今なお語り継がれている。